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          2. 超詳細!手把手教你做RNA pull down

            來源: 武漢金開瑞生物工程有限公司   2020-11-27   訪問量:429評論(0)

            在之前的文章中我們已經了解了RNA pull down 實驗的原理、應用、案例和注意事項(回顧點這里),今天我們來嘮一嘮RNA pull down 實驗的詳細步驟~

            RNA pull down 實驗步驟

            1、構建 RNA 過表達質粒:基因合成 +測序驗證;
            2、體外轉錄模板準備:設計含 T7 啟動子引物,PCR 擴增得到轉錄模板;
            3、體外轉錄:以 PCR 產物為模板,體外轉錄得到目的 RNA;
            4、RNA pull down :通過磁珠 -RNA 探針復合物富集互作的蛋白;
            5、銀染質檢:SDS -PAGE 電泳銀染檢測富集蛋白的情況 ;
            6、質譜鑒定:通過質譜鑒定實驗組與對照的差異蛋白;進而篩選可能的互作蛋白。

            一、構建RNA過表達質粒

            1、首先通過其他手段篩選確定自己感興趣的 RNA (以 下講解lncRNA 為 主);檢索數據庫找到對應的 RNA 堿基序列;
            2、再通過 RACE 擴增是否存在未知序列,由于 lncRNA-RACE 成功率非常低, 嘗試擴增后再確定 RNA pull down 使用的序列;
            3、確認 RNA pull down 使用的序列后,設計引物全基因合成目RNA 序列, 構建到 pcDNA3.1(載體可以根據其他實驗靈活替換)過表達中,并測序驗證序列準確性;
            4、最后提取過表達質粒備用。

            二、體外轉錄模板準備

            實驗分組:
            實驗組:sense 鏈即目的 RNA 序列
            對照組:antisense 鏈即目的 RNA 互補序列
            引物設計方法:
            在正向引物前面加入 T7 啟動子序列;反向引物不變。
            以構建過表達質粒為模板 +設計合成好的引物,擴增得到體外轉錄模板,瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增 PCR 產物情況,切取目的條帶純化回收備用。


            三、體外轉錄

            1、以純化回收的 PCR 產物作為轉錄模板,用體外轉錄試劑盒進行轉錄得到目的 RNA (含 sense 及antisense 兩組);
            2、不同試劑盒轉錄情況(轉錄RNA 大小、轉錄 RNA 量等等)會有所不同。

            四、RNA pull down

            1、蛋白液提前準備:
            優先選擇細胞系:pull -down 實驗前需要提供對應的細胞系,擴大培養后收集細胞裂解提取總蛋白備用;
            組織樣品作為備選:動物或者植物組織液氮研磨后超聲裂解提取總蛋白備用。由于組織樣品需要前處理,且其中包含很多雜質可能會對磁珠富集產生影響,最終影響富集效率導致富集蛋白量較少,進而影響最終鑒定結果。
            2、以上體外轉錄得到的 RNA ,標記生物素后純化備用;
            3、標記生物素 RNA 探針與鏈霉親和素磁珠共孵育形成復合物;
            4、生物素 RNA 探針 -鏈霉親和素磁珠復合物富集蛋白;
            5、富集蛋白洗脫保存。

            五、銀染

            電泳→固定→致敏→染色→顯色→終止


            六、質譜鑒定

            RNA pull down 富集蛋白質譜通常選擇膠條鑒定。
            根據銀染結果來選擇質譜鑒定的方式:
            A、存在肉眼可見差異條帶:
            切取 sense 實驗組泳道中的差異條帶進行膠鑒定。當差異條帶非常多時,節約質譜費用也可以選擇 sense 和 antisense 兩組蛋白液分別進行質譜。

            B、無肉眼可見差異條帶:
            將sense 實驗組和 antisense 對照組兩蛋白液分別進行全譜鑒定,根據鑒定分析結果找出 sense 實驗組中特有的蛋白,進而篩選與自己研究相關的蛋白進行后續驗證。

            C、存在濃度差異條帶:
            也將 sense 實驗組和 antisense 對照組兩蛋白液分別進行全譜鑒定, 根據鑒定分析結果找出 sense 實驗組中特有的蛋白,進而篩選與自己研究相關的蛋白進行后續驗證。


            七、驗證實驗

            根據 RNA pull -down 質譜鑒定分析結果,篩選與自己研究相關的可能互作蛋白。
            購買對應蛋白 IP 級別抗體;或者構建標簽重組過表達質粒 /慢病毒處理細胞。使用目的蛋白抗體或者標簽進行 RIP -QPCR實驗反向驗證。


            八、直播預告

            12月1日(周二)20:00
            直播教你做RNA pull down
            超多實驗小技巧、超多福利等你來

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