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          2. 抗體親和純化系列 ——抗體純化,若有選擇,必是首選

            來源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-12-20   訪問量:448評論(0)

             

            抗體親和純化系列

             

             

            ——抗體純化,若有選擇,必是首選

            Protein A、Protein G、Protein L背景介紹

            Protein A、Protein G是最常應用于抗體親和純化和免疫沉淀的蛋白。將Protein A、G分別固定在不同的介質上,或同時將Protein A、G共價偶聯到介質表面,從腹水、細胞培養物上清和血清中分離IgGIgG亞家族的有效工具。

            將蛋白樣本Protein AProtein G純化IgG,IgG片段和亞類的基礎是二者對IgG-類型的多克隆抗體和單克隆抗體具有很高的特異性親和力。

            1 Protein A、G親和性

            Protein L源于細菌,能更廣泛地結合各種類型以及亞類的免疫球蛋白,包括所有類型的IgG和單鏈可變區(ScFv)以及Fab片段。該蛋白只與抗體的kappa鏈結合而不會影響抗體的抗原結合位點,這一特性使其與蛋白A或蛋白G相比,能更廣泛地結合各種來源及亞類的抗體。

            Yeasen生物提供一系列以蛋白A、蛋白G與蛋白L為核心的抗體純化工具,涵蓋不同類型填料樹脂自動層析預裝柱,方便使用手動或自動化方式純化抗體蛋白質。

            Protein A、G、L樹脂的差異分析

            Beads

            Protein A

            Protein G

            Protein A/G

            Protein L

            優點

            高流速;

            結合能力強;

            特異性與IgGFc片段結合

            高流速;

            結合能力強;

            IgGFcFab片段結合

            高流速;

            結合范圍更廣,兼容A\G共同點;

            結合能力更強;

            實用性更高

            幾乎可以結合所有的Ig(IgG,IgM,IgA,IgEIgD);

            還可以結合單個輕鏈(Scfv)和Fab片段

            缺點

            宿主細胞蛋白的一些非特異性結合

            不能像蛋白A一樣耐受苛刻的洗脫條件

            不結合牛、山羊或綿羊來源的免疫球蛋白

            附表1是關于蛋白A和蛋白G對于不同的免疫球蛋白相對結合力的比較,可用于預測蛋白A或蛋白G作為親和介質時的選用指導。對于來自特別物種IgG的最佳結合條件,應該查閱近期的文獻,獲得最有價值的信息。

            翊圣純化產品選擇指南

            Yeasen生物抗體純化類工具,基因改造后的Protein A/G、Protein L為原料,通過不同化學方法將其定向、高效的偶聯到瓊脂糖基質上,不僅降低了蛋白的非特異性結合、實現了樹脂較高的抗體載量,同時也獲得了適用于不同純化要求的抗體純化產品。

            產品系列

            普通型純化樹脂系列

            快速型純化樹脂系列

            預裝柱系列

            磁珠系列

            Protein A、G 、A/G、L

            Agarose

            Protein A、G 、A/G、L

            4FF Agarose

            Protein A、G、L

            4FF Chromatography Column

            Protein A/G MagBeads (IP Grade)

            平均粒徑d50V

            45-165µm

            45-165µm

            45-165µm

            1μm

            配基

            重組蛋白

            重組耐堿蛋白

            重組耐堿蛋白

            重組Protein A/G

            載量

            Protein A > 40mgIgG/mL

            Protein G > 30mgIgG/mL

            Protein A/G > 20mgIgG/mL

            Protein L > 15mgIgG/mL

            50µgIgG /mg

            最大操作壓力

            0.1MPa,1bar

            0.3MPa,3bar

            0.3MPa,3bar

            -

            支撐物

            4%瓊脂糖微球

            高度交聯4%瓊脂糖微球

            高度交聯4%瓊脂糖微球

            聚合物磁性微球

            優勢

            非特異性結合低,高載量

            非特異性結合極低,高載量高流速,強穩定性

            柱效穩定,高載量,高流速,強穩定性,標準接口適配商品化各類中壓色譜系統

            高純度,高載量,高特異性,配套磁力架使用方便

            推薦應用

            任意規?贵w純化

            任意規?贵w純化,IP,COIP

            小規?贵w純化

            抗體純化,重組蛋白純化,IP,COIP

            純化方法

            親和純化是一種具有可逆反應的生化分離純化技術,如抗原與抗體。適用于從成分復雜且雜質含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。如圖1所示,首先填料與介質偶聯,結合形成具有特異親和性的分離介質,再向柱子中注入樣本,配體選擇性的吸附目標物質,平衡液洗雜,最終用洗脫液將目標物質進行洗脫。

            2 親和層析示意圖

            純化實例

            即使使用結合鼠單抗IgG1比較弱的Protein A 1mL預裝柱,純化效率高于90%。

            3 Protein A純化結果示意圖

            FAQ

            常見問題

            原因分析

            推薦解決方案

            柱子反壓過高

            篩板堵塞

            清洗或更換篩板

            填料堵塞

            參照說明書樹脂清洗

            裂解液中含有微小的固體顆粒,建議上柱前使用濾膜 (0.22或0.45μm)過濾,或者離心去除

            樣品純化過程中曲線不穩定

            樣品或Buffer中含氣泡

            去除樣品或柱子中的氣泡

            樣品和buffer進行脫氣

            洗脫組分中沒有目的蛋白

            樣品中抗體濃度太低

            適當提、高抗體濃度

            抗體被降解

            蛋白洗脫后應立即中和,適當提高洗脫液pH

            樣本與純化介質柱不匹配

            參照表1選擇合適的純化介質

            電泳loading buffer DTT失效

            使用新鮮配制loading buffer

            洗脫緩沖液pH不對

            依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脫,電泳檢測產物

            結合緩沖液pH不對

            應保證樣本和結合緩沖液pH在7.0

            回收率逐漸降低

            上樣量過多

            減少上樣量

            柱子太臟,載量降低

            參照說明書進行樹脂清洗

            樣本中脂蛋白、酚紅、小分子污染物等的去除

            每毫升樣品中加入0.04mL硫酸右旋葡糖酐和1mL 1M CaCl2沉淀脂蛋白,離心除去

            PVP加樣品中至終濃度為3%沉淀b-脂蛋白和球蛋白,離心去除

            結合緩沖液稀釋樣本

            脫鹽柱除去酚紅

            分級沉淀法去除低分子污染物,可采用硫酸銨沉淀,羊脂酸沉淀等方法

            抗體藥物純化過程中,降低聚集體含量

            在上游細胞培養,控制最佳的收獲時機,避免培養過程中抗體聚集

            低pH洗脫液中,加入保護劑(Arg等)

            低pH洗脫后,快速中和

            適當降低親和層析柱進樣量

            樣品處理和純化過程中,保持低溫(4-8℃)

            訂購信息

            產品名稱

            貨號

            規格mL

            價格(元)

            蛋白A瓊脂糖純化樹脂

            36401ES08/25/60

            5 /25 /100

            546/2186/7426

            蛋白A瓊脂糖快速純化樹脂

            36402ES08/25/60

            5 /25 /100

            866/2656/8856

            蛋白A/G瓊脂糖純化樹脂

            36403ES03/05/08/25/60

            1/2/5/25/100

            278/538/878/2886/7426

            蛋白A/G瓊脂糖快速純化樹脂

            36404ES08/25/60

            5 /25 /100

            978/3186/8726

            蛋白G瓊脂糖純化樹脂

            36405ES08/25/60

            5 /25 /100

            546/2186/7426

            蛋白G瓊脂糖快速純化樹脂

            36406ES08/25/60

            5 /25 /100

            978/3186/8726

            蛋白L瓊脂糖純化樹脂

            36407ES08/25/60

            5 /25 /100

            2488/9988/16488

            蛋白L瓊脂糖快速純化樹脂

            36408ES08/25/60

            5 /25 /100

            2868/13288/27688

            蛋白A純化預裝柱,1mL

            36409ES03/08

            1 mL/5×1 mL

            528/2218

            蛋白A純化預裝柱,5mL

            36410ES08/25

            5 mL/5×5 mL

            1848/6838

            蛋白G純化預裝柱,1mL

            36413ES03/08

            1 mL/5×1 mL

            528/2218

            蛋白G純化預裝柱,5mL

            36414ES08/25

            5 mL/5×5 mL

            1848/6838

            蛋白L純化預裝柱,1mL

            36415ES03/08

            1 mL/5×1 mL

            938/3748

            蛋白L純化預裝柱,5mL

            36416ES08/25

            5 mL/5×5 mL

            3528/14088

            蛋白A/G免疫沉淀磁珠

            36417ES03/08

            1/5

            787/2937

            參考文獻

            [1] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407.

            [2] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412.

            [3] Chen Y, Tang J, Lu T, Liu F. CAPN1 promotes malignant behavior and erlotinib resistance mediated by phosphorylation of c-Met and PIK3R2 via degrading PTPN1 in lung adenocarcinoma. Thorac Cancer. 2020;11(7):1848-1860 Protein A/G MagBeads IF: 2.61

            [4] Zhao Q, Liu Y, Wang T, et al. MiR-375 inhibits the stemness of breast cancer cells by blocking the JAK2/STAT3 signaling [published online ahead of print, 2020 Jul 30]. Eur J Pharmacol. 2020;884:173359.

            Protein A/G Agarose Resin IF: 3.263

            附表:

            1 蛋白A蛋白G對不同免疫球蛋白的結合力

            免疫球蛋白來源

            亞類

            蛋白A結合力

            蛋白G結合力

            人類Human

            IgG

            +++

            +++

            IgG1

            ++++

            ++++

            IgG2

            ++++

            ++++

            IgG3

            -

            +++

            IgG4

            ++++

            ++++

            IgA

            可變的

            -

            IgA1

            +

            -

            IgA2

            +

            -

            IgD

            -

            -

            IgE

            ++

            -

            IgM

            +

            -

            Rabbit

            IgG

            +++

            +++

            Cow

            IgG

            +

            +++

            IgG1

            +

            +++

            IgG2

            +++

            +++

            Cat

            IgG

            +++

            +

            Horse

            IgG

            ++

            ++++

            山羊Goat

            IgG

            +

            ++

            IgG1

            +

            +++

            IgG2

            +++

            +++

            豚鼠Guinea pig

            IgG1

            ++

            +

            IgG2

            ++

            +

            綿羊Sheep

            IgG

            +

            ++

            IgG1

            +

            ++

            IgG2

            +++

            +++

            Dog

            ++

            +

            Pig

            +++

            ++

            大鼠Rat

            IgG

            +

            ++

            IgG1

            -

            +

            IgG2a

            -

            ++++

            IgG2b

            -

            ++

            IgG2c

            ++

            ++

            IgG3

            +

            ++

            小鼠Mouse

            IgG

            ++

            ++

            IgG1

            +

            ++++

            IgG2a

            ++++

            ++++

            IgG2b

            +++

            +++

            IgG3

            ++

            +++

            IgM

            -

            -

            Chicken

            IgY

            -

            -

            恒河猴Monkey rhesus

            IgG

            ++++

            ++++

            倉鼠Hamster

            +

            ++

            考拉Koala

            -

            +

            美洲駝Llama

            -

            +

            HB201215



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