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          2. Science子刊| 王紅陽院士團隊揭示肝內膽管細胞癌“老藥新用”治療新策略

            來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2020-12-25   訪問量:721評論(0)

            肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是指左右肝管匯合部以上的膽管上皮細胞起源的惡性腫瘤。ICC在成人原發性肝癌中居第二位,約占原發性肝癌患者的10%,且近年來發病率不斷增加,慢性炎癥和膽道梗阻造成的膽管細胞慢性損傷是膽管細胞癌發病的兩個重要因素。ICC惡性程度高、癥狀隱匿、臨床就診時多屬晚期,可手術率低,常規放化療對ICC的療效非常有限,在其他腫瘤中已顯示明確療效的靶向治療、免疫治療等手段在ICC中也鮮見成功。且ICC預后普遍較差,5年生存率低于5%~10%。因此,尋找新的治療方法和藥物對晚期或復發的肝內膽管癌患者治療十分急需。

            圖1. 根據解剖部分膽管癌分型。(引自Liver International. 2019;39(Suppl. 1):7–18.)


            9月23日,國家肝癌科學中心王紅陽院士團隊在國際著名期刊《Science Translational Medicine》(2019年影響因子16.304,5年影響因子18.559)在線發表了題為“PTEN status determines the chemosensitivity to proteasome inhibition in cholangiocarcinoma”的重磅論文。研究發現了明星抑癌分子PTEN在肝內膽管癌的特殊作用,并以此分子機理研究的進展引領了臨床精確分型和治療新策略的應用,為肝內膽管細胞癌治療帶來了新的進展和突破,為無藥可用的病人帶來了生存希望。王紅陽院士團隊長期致力于惡性腫瘤的基礎與臨床研究,尤其在肝膽腫瘤的早期診斷與精準治療領域有多項創新科研成果和臨床應用轉化,此項研究是他們在肝內膽管細胞癌研究中取得的又一重要突破。


            王紅陽院士與研究團隊成員合照


            作者首先建立了膽管癌患者來源異種移植模型(Patient-derived xenografts,PDXs)并得到PDX來源的細胞(PDX-derived cells,PDCs),應用PDX/PDC庫膽管癌原代細胞分離技術在69種FDA批準的抗癌藥庫中篩選,結果發現硼替佐米(bortezomib,多發性骨髓瘤治療藥物)對PDCs具有強大的細胞毒性作用。


            通過對膽管癌細胞系驗證發現,不同細胞系對蛋白酶抑制劑的敏感性不同,可分為Bortezomib敏感型和不敏感型兩群。選取兩種代表性細胞系HCCC-9810(敏感)和RBE(不敏感),轉錄組學分析發現PI3K-AKT和泛素介導的蛋白水解通路在Bortezomib敏感細胞系HCCC-9810中顯著上調,即敏感型細胞系具有更高的蛋白酶體活性。


            接下來對高敏感和低敏感細胞進行全基因組測序,對比分析發現,高敏感細胞系HCCC-9810在10號染色體抑癌基因pten所在區段發生斷裂丟失,而PTEN是一個著名的抑癌基因,其編碼的蛋白可以抑制PI3K-AKT信號。進一步靶向基因的深度測序(平均深度>4000X)發現pten在ICC中存在多種突變,突變病例比例超過40%。非常值得關注的是Bortezomib敏感型細胞系均含有PTEN的突變或者蛋白缺失,而Bortezomib不敏感的細胞系均表達完整的PTEN。

            圖2. Pten突變缺失的膽管癌對Bortezomib敏感


            那么,PTEN對蛋白酶體抑制劑敏感性調節的分子機制是什么?


            通過對比Bortezomib敏感和不敏感膽管癌細胞的表達譜,發現泛素-蛋白酶體信號通路在敏感性(PTEN缺失)細胞中異;罨。隨后,應用吉凱基因提供的RNA干擾慢病毒和Cas9敲除PTEN慢病毒表達驗證了PTEN對蛋白酶體組分表達的調控作用。已有文獻報道,26S蛋白酶體組分的表達很大程度上受抗氧化應激反應元件(ARE)調節,其中ARE相關蛋白NRF1和NRF2是最重要的兩個轉錄因子。目前,PTEN與NRF1及NRF2的相關性尚不明確,PTEN與ARE其它轉錄因子關系的報道幾乎沒有。隨后的實驗證實PTEN對ARE轉錄活性具有調節作用,但是這種作用不依賴于NRF1/2。針對參與ARE轉錄調控的因子,我們做了逐個驗證,發現BACH1和MAFF是兩個參與PTEN對蛋白酶體表達和活性調節的主要因子。當BACH1和MAFF表達增加時,膽管癌細胞對Bortezomib的反應性顯著下降,而敲低它們則會提高藥物的敏感性。抑制BACH1和MAFF也會減弱PTEN對蛋白酶體水解活性的抑制作用和ARE轉錄活性。進一步研究揭示,PTEN-PI3K-AKT-FOXO1信號軸調節BACH1和MAFF的轉錄表達,FOXO1直接結合到兩個基因的啟動子區發揮轉錄調節作用。在PTEN缺失的細胞里,AKT具有較高的活性,FOXO1被屏蔽在細胞質中,這時BACH1和MAFF表達水平很低,蛋白酶體組分基因的轉錄抑制解除。因而,相比于PTEN野生型細胞,缺失型細胞具有更高的蛋白合成速率和更高的蛋白酶體活性,當應用蛋白酶體抑制劑時大量蛋白發生聚集,腫瘤細胞因蛋白毒性應激而死亡。


            圖3. PTEN通過PI3K-AKT-FOXO1途徑調節Bach1/MAFF轉錄調控蛋白酶體組分表達


            為了給膽管癌提供更好的研究工具,課題組構建了基于PTEN缺失的ICC自發動物模型。應用PTEN敲除小鼠和Kras小鼠進行雜交,可以得到Kras PTEN Alb-CRE 小鼠。小鼠出生后8周即出現腹部膨脹、嚴重腹水、膽囊腫大、膽管梗阻、肝上出現腫瘤等表現。病理學檢測譜系標志物確認其為膽管癌(Cancer Lett. 2018 May 1;421:161-169.)。應用這一自發膽管癌模型,課題組對發現的多個基因的功能進行了研究。例如,他們發現敲除RMP基因強烈抑制ICC發生發展。RMP通過其蛋白分子中D2區域競爭性結合KEAP1蛋白分子中Kelch區域,減少NRF2蛋白降解,從而提高細胞存活和抗氧化能力。該研究闡明了ICC發生過程中腫瘤細胞如何獲得生存能力的可能機制。這一部分內容發表于Hepatology雜志(Hepatology. 2020 Jun;71(6):2005-2022.)。

            圖4. RMP通過競爭性結合KEAP1穩定NRF2蛋白


            依據良好的臨床前研究數據,課題組申請開展了應用蛋白酶體抑制劑Bortezomib進行療效觀察的臨床研究(NCT03345303)。運用分子靶向抑制藥物和常規化療藥物,治療顯示不同PTEN類型的膽管癌病人,確定基于PTEN分子分型的膽管癌治療新策略新方案;展開基于不同PTEN背景的膽管癌臨床研究工作,觀察和評價制定的化療方案對病人的治療效果。該工作既為研發膽管癌新藥提供新的靶點,也為患者帶來針對性治療和延長生存的福音。


            1. 基于PDXs/PDCs藥物篩選技術,發現蛋白酶體抑制劑在PTEN缺陷型膽管癌具有顯著療效。機制研究發現PTEN-AKT-FOXO1-BACH1/MAFF通路可介導蛋白酶體基因的轉錄抑制,并賦予了腫瘤對蛋白酶體抑制劑硼替佐米治療的抗性;


            2. GDSC,CTRP,CCLE和TCGA數據庫分析結果顯示:PTEN缺陷使多種腫瘤對蛋白酶體抑制治療敏感,這或將對多種腫瘤的治療具有重要意義;


            3. 硼替佐米Bortezomib是目前臨床治療多發性骨髓瘤的一線靶向藥物,藥物安全性有保障。若該治療策略在臨床研究中可以得到證實,將會為眾多腫瘤患者的治療帶來新的選擇。

            用于敲減和敲除PTEN的慢病毒由吉凱基因提供,感染腫瘤細胞系(感染參數:polybrene 4 μg/ml;puromycin篩選濃度2 μg/ml)48h后進行蛋白表達水平驗證,結果顯示PTEN 蛋白表達明顯下調。


            載體及靶點:

            PTEN干擾慢病毒載體hU6-MCS-CMV- Puromycin,干擾靶點5′-CCACAGCTAGAACTTATCAAA-3′ (shPTEN#1)和5′-AAGTGCCTCGTTTCCTTTAA-3′ (shPTEN#2, for 3′UTR)。


            PTEN CRISPR KO 慢病毒載體hU6-sgRNASV40-EGFP vectors,靶點sg#7401: 5′-ACCGCCAAATTTAATTGCAG-3′和sg#7403: 5′-ACGCCTTCAAGTCTTTCTGC-3′。

            Western blotting結果顯示慢病毒感染后PTEN蛋白表達明顯下調


            作者簡介


            上海東方肝膽外科醫院/國家肝癌科學中心王紅陽院士、談冶雄教授、董立巍教授為論文共同通訊作者,研究生蔣添翼和潘宇飛、萬正華博士為共同第一作者。該研究得到國家科技部、國家自然科學基金委和上海市科委等項目經費支持。課題組依托于東方肝膽外科醫院和國家肝癌科學中心的國科金創新群體,教育部和上海市重點實驗室平臺的支撐。


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