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          2. 瓊脂糖凝膠電泳實驗方法及原理

            來源: 上海聯碩生物科技有限公司   2020-12-30   訪問量:660評論(0)

            實驗方法原理

            瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的主要區別是:它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。

            瓊脂糖凝膠具有網絡結構,物質分子通過時會受到阻力,大分子物質在涌動時受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大,對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道,現廣泛應用于核酸的研究中。

            蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷,在電場中受力大小不同,因此跑的速度不同,根據這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間,離子強度0.02~0.05適合。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區分相差100 bp的DNA/片段,其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低,但它制備容易,分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20 kb,利用脈沖電泳,可分離高達107 bp的DNA/片段。

            DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質,相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

            實驗材料 DNA

            試劑、試劑盒 瓊脂糖TBE電泳緩沖液電泳載樣緩沖液溴化乙錠(EB)溶液母液DNAGreen

            儀器、耗材 水平式電泳裝置電泳儀臺式高速離心機恒溫水浴鍋微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相支架照相機及其附件

            實驗步驟

            一、試劑配制

            1. 5×TBE緩沖液:450 mmol/L Tris-硼酸,10 mmol/L EDTA,pH值8.0。使用時將上述儲存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液,可同時作為電泳及制膠用的緩沖液。

            二、制膠

            1. 根椐制膠量及凝膠濃度,在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中,加入準確稱量的瓊脂糖粉(總液體量不宜超過錐瓶的50%

            容量)。瓊脂糖粉末與0.5×TBE buffer的比例(w:v)參考表1,常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。

            瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的分辨范圍


            2. 在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙,并在膜或紙上扎些小孔,然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時,當溶液沸騰后,請戴上防熱手套,小心搖動錐瓶,使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復數次,直至瓊脂糖完全溶解。

            3. 使溶液冷卻至50℃-60℃左右,如需要可在此時加入溴化乙錠溶液(終濃度0.5 μg/ml)或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料,并充分混勻。

            4. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,然后在適當位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5 mm之間。制膠模如下圖所示,小膠倒入25-30 mL左右瓊脂糖溶液,大膠則60-70 mL左右,若需切膠回收,凝膠可適當加厚。

            5. 在室溫下使膠凝固,大約30分鐘~1小時。

            三、上樣

            1. 取適量樣品與6×上樣緩沖液混勻(如:1 μl樣品與5 μl 6×上樣緩沖液),用微量移液槍小心加入樣品槽中。

            2. 上樣量根據樣品濃度可適當調整,若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量(一般小孔40 μl 為上限,大孔200 μl 為上限,具體和制膠膜規格相關)。

            3. 每加完一個樣品要更換槍頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。

            四、電泳

            1. 加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源?刂齐妷罕3衷110 V,電流在40 mA以上。

            2. 當條帶移動到距凝膠前沿約2 cm時(約40 min),停止電泳。

            3. 紫外下拍照并觀察。

            注意事項

            1. 5×TBE緩沖液放置時間過久會沉淀,因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5×TBE緩沖液,取5×TBE緩沖液貯存液稀釋,現配現用。

            2. 用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統一。

            3. 瓊脂糖粉在微波爐中加熱時間不宜過長,每次當溶液起泡沸騰時停止加熱,否則會引起溶液過熱暴沸,造成瓊脂糖凝膠濃度不準,也會損壞微波爐。溶解瓊脂糖時,必須保證瓊脂糖充分完全溶解,否則,會造成電泳圖像模糊不清。

            4. 凝膠不立即使用時,請用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天



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